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8/17

【時間】 9:00~17:00

【実験担当】岩城,福山,古道,革島,吉村

【実験目的】
(1)pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック
(2)pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ
(3)コンピテントセルの調整

【実験内容】
(1)pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、それぞれ
  pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml)
  pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml)
  に入れ、6時間ほど振とう培養。
  ↓
  それぞれをアルカリミニプレップ
  ↓
  制限酵素処理
  ・ミリQ 11μl
  ・Hバッファー 2μl
  ・DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)) 5μl
  ・制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ) 各1μl
  ↓
  1時間37℃でインキュベート
  ↓
  電気泳動





【実験結果】
(1)バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する。

8/16

【時間】 9:00~17:00
【実験担当】岩城,福山,竹内,臼井,足立,中村,革島
【実験内容】
・pSB3K3をYT培地30ml(+kan),pSB6A1をYT培地30ml(+amp)で大量培養
→pSB1A2(1-B)は目的のインサートを持たないものであったため
 改めてpSB1A2(12-M)をトランスフォーメーションした。

・パーツ登録時に使用するベクターpSB1C3(3-A)をトランスフォーメーションした。

・SodA,ProxyR,AcrABのプライマー設計&注文!→四日後くらいに来るらしい。

8/15

【時間】 9:00~18:00
【実験担当】坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村
【実験内容】
(1)pSB1のカットチェック
  →4つ中2番にバンドが確認された。
   2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地2mLを加え、振とう培養した。

(2)pSB3K3のアルカリミニプレップ
   →4本を作成した。(もう1本は×)

(3)pSB3K3のカットチェック
  →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された。
   LB培地(+kan)2mLを加え、振とう培養した。

(4)ゲルの作成
  →1%アガロースゲル(8レーン)を10枚作成した。

  
(3)100V,30minで電気泳動
(4)EtBrにGelを20min浸ける
(5)Band撮影

8/14

PSB1→再度カットしなおしてもバンドが消える。
         DNaseのコンタミの可能性・・・
         ミニプレからやり直したので、明日電気泳動してみる。
    PSB6→とりあえず放置。
    PSB3K3→コロニーが2つだけ・・・(ピンク)。とりあえずピックアップしてプレカルチャー。
           明日はミニプレップしてカットチェック。

8/13

【時間】
9:00~21:00
【実験担当】
岩城,竹内,中村,吉村,足立
【実験名】
(1) pSB3K3のトランスフォーメーション
(2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
(3) pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
【実験目的】
(1) LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
(2) pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
(3) DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック
【実験内容】
(1) pSB3K3のトランスフォーメーション
 -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
 ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
 ↓on ice 30min
 ↓45℃で45sec、ヒートショックを行った
 ↓on ice 2min
 ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
 ↓37℃で1h、振とう培養した
 ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
(2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
 培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った
 ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
 ↓5min on ice
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
 ↓上澄みを捨てた
 ↓30秒間遠心乾燥を行った
 ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
(3) pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
組成1(pSB1A2) 組成2(pSB6A1)
XbaⅠ,PstⅠ 1μL 1μL
(2)で得たpSB1A2 5μL -
(2)で得たpSB6A1 - 5μL
H2O 11μL 11μL
H Buffer 1μL 2μL
M Buffer 1μL -
計 20μL 20μL
37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
 (マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した
【実験結果】
(1) コロニーが2つだけ確認できた(ピンク)
(3) pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた
翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
pSB1A2→Bandが現れなかった
翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う
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