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8/23

【時間】 9:00~21:00

【実験担当】岩城,竹内,中村,臼井,吉村

【実験名】
(1)大腸菌の生存曲線を調べる
(2)dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
(3)dps,acrABのDNA濃度測定
【実験目的】
(1)大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
(2)活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
(3)dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。
【実験内容】
(1)30% H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくる

4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくる

以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成。

次にDH5αのシングルコロニーをピックアップ

LB(-amp)(2ml)でプレカルチャー(37℃でインキュベート、overnight)

(2)dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った。

〈組成〉(dps,grxA,trxC)     〈組成〉(oxyR)
・PrimerR・・・・・・・1.5μL       ・PrimerR・・・・・・・・・・・・3μL
・PrimerF・・・・・・・1.5μL       ・PrimerF・・・・・・・・・・・・・3μL
・dNTP・・・・・・・・・・・5μL       ・dNTP・・・・・・・・・・・・・・・20μL
・Buffer・・・・・・・・・・・5μL       ・Buffer(KOD-FX)・・・50μL         
・DNA(DH5α)・・・0.5μL      ・DNA(DH5α)・・・・・・・・2μL
・MgSO4・・・・・・・・・・4μL       ・MilliQ・・・・・・・・・・・・・・20μL
・MilliQ・・・・・・・・・・31.5μL      ・KOD-FX・・・・・・・・・・・2μL
・KOD-Plus・・・・・・・1μL
全量・・・・・・・・・・・・50μL       全量・・・・・・・・・・・・・・・100μL

〈PCRの設定〉               
1.Pre Penature・・・94℃―2min     1.Pre Penature・・・94℃―2min
2.Denature・・・・・・・94℃―15sec     2.Denature・・・・・・・94℃―10sec
3.Annealing・・・・・・59.7℃―30sec    3.Annealing・・・・・・52℃―30sec
4.Extension・・・・・・68℃―30sec     4.Extension・・・・・・68℃―45sec
5.+Extension・・・・・68℃ー2min     5.+Extension・・・・・68℃ー2min
*dps、grxA 、trxC            *oxyR
またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを1回目 100V、20min EtBr 20min
2回目 135V、15min EtBr 10min で行った。


(3)吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった。


【実験結果】
(2)1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった。
2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった。
*詳細は写真参照

(3)吸光度の測定結果
以下の吸光度の結果から、PCRに十分と判断された。



 吸光度 dps      acrAB 
 1回目 0.340   0.565
 2回目  0.329  0.555
 3回目  0.314  0.556
 4回目  0.309  0.556
 5回目  0.312  0.551
 平均値

 0.321

0.557 


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