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8/21

【時間】 9:00~

【実験担当】竹内、革島、足立、吉村
 
【実験名】
(1)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
(2)DH5α(R0040),DH5α(I13522)のアルカリミニプレップ
(3)AcrAB,PoxyのPCR
 
 
 
【実験目的】
(1)DH5αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック
(2)DH5α(R0040),DH5α(I13522)のプラスミド抽出
(3)AcrAB,PoxyのPCR
 
【実験内容】
(1)
8月20日(金)にアルカリミニプレップによってプラスミドDNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))を取り出したものの確認を電気泳動によって行った。
 
<手順>
(1)pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450)5μLずつにそれぞれLoading Buffer 1μLを加え六倍希釈にしコームに流した。
      ↓
1kbp radderをマーカーとして使用し電気泳動を行った(100V,25min)
      ↓
EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min
      ↓
泳動結果を写真撮影した。
 
(2)

8月20日(金)に培養したDH5α(R0040),DH5α(I13522)1.5mL1.5mLマイクロチューブに移す。

  ↓

4℃、14,000rpm5min遠心

  ↓

上澄みをデカンテーションで取り除く

  ↓

菌体ペレットを氷冷したSoltion100μLに懸濁(vortex)

  ↓

Solution200μLを加え混合(vortex不可)・・・5min on ice

  ↓

Solution150μLを加え混合(vortex)・・・・・5min on ice

  ↓

4℃、14,000rpm10min遠心

  ↓

上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す

  ↓

等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える

  ↓

4℃、14,000rpm20min遠心

  ↓

70EtOHを1mL加える(vortex)

  ↓

4℃、14,000rpm10min遠心

  ↓

30sec 遠心乾燥

  ↓

RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAにする

 

カットチェック(電気泳動)

 <組成>

 EcoRⅠ,PstⅠ・・・・1μL

 プラスミドDNA・・・5μL

 (DH5α(R0040),DH5α(I13522))

 H2O・・・・・・・・11μL

 H Buffer・・・・・・2μL

                   計20μL

→ 1h,37℃でインキュベート

 Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した

(マーカーは1kbp radderを使用した)

        ↓

100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

        ↓

泳動結果を写真で撮影した

 

(3)AcrAB,oxyRのPCR試薬組成

    (1)    (2)     (3) 
 テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL  2μL 
  MgSO4 2μL 1.5μL  1.5μL 
プライマーF 1.5μL 1.5μL  1.5μL 
 プライマーR 1.5μL 1.5μL  1.5μL 
 KOD -Plusー 1μL 1μL  1μL 
  H2O 33μL 31μL  32μL 
dNTPs 5μL 5μL  5μL 
  total 50μL 50μL 50μL

(設定)
Pre Denature・・・94℃、2min
35Cycles↓
・Denature・・・・・・・94℃、15sec
・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
・Extension・・・・・・68℃、20sec
            4℃、∞
結果は写真参照
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