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8/20

【時間】 9:00~

【実験担当】福山、古道、竹内、革島

【実験名】
(1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2))DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]とDH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I]のプレカルチャー
(3)2%アガロースゲルの作成
(4)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

【実験目的】
(1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出
(3)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

【実験内容】
(1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した
pUC19・・・・・0.005ng/μL
pUC19・・・・・0.05ng/μL
pUC19・・・・・0.5ng/μL
       ↓
これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した

(2)プレカルチャー
DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

(3)2%アガロースゲルの作成
<組成>
 ・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL
 ・Ultra Pure Agarose・・・3g

<手順>
 150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する
        ↓
 60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む
        ↓
 ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する

(4)
培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL
  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
上澄みをデカンテーションで取り除く
  ↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
  ↓
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
  ↓5min on ice
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
  ↓5min on ice
4℃、15,000rpm、10min遠心
  ↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
  ↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心
70%EtOHを1mL加える(vortex)
  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心
上澄みを捨てる
 ↓30sec 遠心乾燥
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする

(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

・材料
 プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)
1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚
TAE Buffer
Buffer QG
Isopropanol
・実験操作
50V、60minで電気泳動。
          ↓
1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
          ↓ 
EtBrを取り除いた。
          ↓
暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。                    
          ↓
切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g
pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g
          ↓
ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL
pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL
          ↓ 
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)

溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。
          ↓
カラムに移し替え、10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
Buffer PE 0.75mLを加えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
(このエッペンの蓋は切っていない。)
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。

【実験結果】
(1)
コロニー数
pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個     
pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個     →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg
pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個    →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg

平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)
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