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8/19

【時間】 9:00~

【実験担当】岩城、古道、竹内、中村

【実験名】
(1)l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
(3)pSB1C1(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ(18日の続き)
(4)PoxyR、acrABのPCRと電気泳動

【実験目的】
(1)l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る
(3) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
(4)プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
【実験内容】
(1)-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解
          ↓
  DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
          ↓
  on ice 30min
          ↓
  45℃で45sec、ヒートショック
          ↓
  on ice 2min
          ↓
  各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
          ↓
  37℃で1h、振とう培養
          ↓
  培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight

(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした。
       ↓
  37℃でインキュベート 

(3)E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanol 3.5mLを加えた
            ↓
  15,000×g、4℃、30min 遠心
            ↓
  遠心後、上清を捨てた
            ↓
  37℃でインキュベートし、適度に乾燥(乾かしすぎない!)
            ↓
  TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵
            ↓
  これの吸光度を計測した

(4)PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
(組成)
PrimerF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
PrimerR・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
テンプレートDNA(DH5α、JM109)・・・・・・1μL
Buffer for KOD-Plus・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM dNTPs・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM MgSO4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2μL
KOD-Plus(1U/μL)・・・・・・・・・・・・・・・・・・1μL
MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33μL

(設定)
Pre Denature・・・94℃、2min
Denature・・・・・・・94℃、15sec
Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
Extension・・・・・・68℃、20sec
            4℃、∞

PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした

DNA量・・・・・・・・・・・5μL
Loading Buffer・・・・1μL
の割合で、1%アガロースゲルを用いて、100V、15min泳動した

【実験結果】
(3)吸光度の結果
     pSB6    pSB1C3
1回目 1.132    0.155
2回目 0.994    0.138
3回目 0.984    0.126
4回目 0.990    0.122
5回目 0.975    0.125
平均  1.015    0.1332
*DNA1μLに対し、MilliQ99μLを加え。100倍希釈で測定

(4)写真参照
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