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8/18

【時間】 9:00~

【実験担当】岩城、古道、竹内、中村

【実験名】
(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
(2)BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(5)pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(←前日の大量培養がコンタミした為)
(6)pSB1A2の大量培養
(7)pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
【実験目的】
(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のシングルコロニーを得る
(2)BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
(3)作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(5)19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
(6)pSB1A2の大量培養
(7)pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ

【実験内容】
(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)をLBプレート(+amp)にストリーク
              ↓
  37℃でインキュベート(Overnight)


(2)BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート(+amp)にストリーク
              ↓
  37℃でインキュベート(Overnight)

(3)前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
          ↓
  SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養
          ↓
  その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養
          ↓
  吸光度測定した(*実際は牛島さんに測っていただいた)

(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)をDH5αにトランスフォーメーションした
             ↓
  37℃でインキュベート(Overnight)

(5)pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
             ↓
  pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Km)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+クロラムフェニコーム)に大量培養

(7)大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
         ↓
  比重計で、それぞれ等量を量った
         ↓
  各チューブを4℃、4000×gで10min 遠心
         ↓
  この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
         ↓
  遠心後、上清を捨てた
         ↓
  沈殿にR3 4mLを加えて、Vortex
         ↓
  L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置
         ↓
  N3 4mLを加えた
         ↓
  室温、12,000×gで10min遠心
         ↓
  上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
         ↓
  カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
         ↓
  カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
*以降の操作は翌日に繰り越し
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