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8/23

【時間】 9:00~21:00

【実験担当】岩城,竹内,中村,臼井,吉村

【実験名】
(1)大腸菌の生存曲線を調べる
(2)dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
(3)dps,acrABのDNA濃度測定
【実験目的】
(1)大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
(2)活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
(3)dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。
【実験内容】
(1)30% H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくる

4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくる

以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成。

次にDH5αのシングルコロニーをピックアップ

LB(-amp)(2ml)でプレカルチャー(37℃でインキュベート、overnight)

(2)dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った。

〈組成〉(dps,grxA,trxC)     〈組成〉(oxyR)
・PrimerR・・・・・・・1.5μL       ・PrimerR・・・・・・・・・・・・3μL
・PrimerF・・・・・・・1.5μL       ・PrimerF・・・・・・・・・・・・・3μL
・dNTP・・・・・・・・・・・5μL       ・dNTP・・・・・・・・・・・・・・・20μL
・Buffer・・・・・・・・・・・5μL       ・Buffer(KOD-FX)・・・50μL         
・DNA(DH5α)・・・0.5μL      ・DNA(DH5α)・・・・・・・・2μL
・MgSO4・・・・・・・・・・4μL       ・MilliQ・・・・・・・・・・・・・・20μL
・MilliQ・・・・・・・・・・31.5μL      ・KOD-FX・・・・・・・・・・・2μL
・KOD-Plus・・・・・・・1μL
全量・・・・・・・・・・・・50μL       全量・・・・・・・・・・・・・・・100μL

〈PCRの設定〉               
1.Pre Penature・・・94℃―2min     1.Pre Penature・・・94℃―2min
2.Denature・・・・・・・94℃―15sec     2.Denature・・・・・・・94℃―10sec
3.Annealing・・・・・・59.7℃―30sec    3.Annealing・・・・・・52℃―30sec
4.Extension・・・・・・68℃―30sec     4.Extension・・・・・・68℃―45sec
5.+Extension・・・・・68℃ー2min     5.+Extension・・・・・68℃ー2min
*dps、grxA 、trxC            *oxyR
またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを1回目 100V、20min EtBr 20min
2回目 135V、15min EtBr 10min で行った。


(3)吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった。


【実験結果】
(2)1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった。
2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった。
*詳細は写真参照

(3)吸光度の測定結果
以下の吸光度の結果から、PCRに十分と判断された。



 吸光度 dps      acrAB 
 1回目 0.340   0.565
 2回目  0.329  0.555
 3回目  0.314  0.556
 4回目  0.309  0.556
 5回目  0.312  0.551
 平均値

 0.321

0.557 


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8/21

【時間】 9:00~

【実験担当】竹内、革島、足立、吉村
 
【実験名】
(1)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
(2)DH5α(R0040),DH5α(I13522)のアルカリミニプレップ
(3)AcrAB,PoxyのPCR
 
 
 
【実験目的】
(1)DH5αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック
(2)DH5α(R0040),DH5α(I13522)のプラスミド抽出
(3)AcrAB,PoxyのPCR
 
【実験内容】
(1)
8月20日(金)にアルカリミニプレップによってプラスミドDNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))を取り出したものの確認を電気泳動によって行った。
 
<手順>
(1)pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450)5μLずつにそれぞれLoading Buffer 1μLを加え六倍希釈にしコームに流した。
      ↓
1kbp radderをマーカーとして使用し電気泳動を行った(100V,25min)
      ↓
EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min
      ↓
泳動結果を写真撮影した。
 
(2)

8月20日(金)に培養したDH5α(R0040),DH5α(I13522)1.5mL1.5mLマイクロチューブに移す。

  ↓

4℃、14,000rpm5min遠心

  ↓

上澄みをデカンテーションで取り除く

  ↓

菌体ペレットを氷冷したSoltion100μLに懸濁(vortex)

  ↓

Solution200μLを加え混合(vortex不可)・・・5min on ice

  ↓

Solution150μLを加え混合(vortex)・・・・・5min on ice

  ↓

4℃、14,000rpm10min遠心

  ↓

上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す

  ↓

等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える

  ↓

4℃、14,000rpm20min遠心

  ↓

70EtOHを1mL加える(vortex)

  ↓

4℃、14,000rpm10min遠心

  ↓

30sec 遠心乾燥

  ↓

RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAにする

 

カットチェック(電気泳動)

 <組成>

 EcoRⅠ,PstⅠ・・・・1μL

 プラスミドDNA・・・5μL

 (DH5α(R0040),DH5α(I13522))

 H2O・・・・・・・・11μL

 H Buffer・・・・・・2μL

                   計20μL

→ 1h,37℃でインキュベート

 Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した

(マーカーは1kbp radderを使用した)

        ↓

100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

        ↓

泳動結果を写真で撮影した

 

(3)AcrAB,oxyRのPCR試薬組成

    (1)    (2)     (3) 
 テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL  2μL 
  MgSO4 2μL 1.5μL  1.5μL 
プライマーF 1.5μL 1.5μL  1.5μL 
 プライマーR 1.5μL 1.5μL  1.5μL 
 KOD -Plusー 1μL 1μL  1μL 
  H2O 33μL 31μL  32μL 
dNTPs 5μL 5μL  5μL 
  total 50μL 50μL 50μL

(設定)
Pre Denature・・・94℃、2min
35Cycles↓
・Denature・・・・・・・94℃、15sec
・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
・Extension・・・・・・68℃、20sec
            4℃、∞
結果は写真参照

8/20

【時間】 9:00~

【実験担当】福山、古道、竹内、革島

【実験名】
(1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2))DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]とDH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I]のプレカルチャー
(3)2%アガロースゲルの作成
(4)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

【実験目的】
(1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出
(3)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

【実験内容】
(1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した
pUC19・・・・・0.005ng/μL
pUC19・・・・・0.05ng/μL
pUC19・・・・・0.5ng/μL
       ↓
これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した

(2)プレカルチャー
DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

(3)2%アガロースゲルの作成
<組成>
 ・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL
 ・Ultra Pure Agarose・・・3g

<手順>
 150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する
        ↓
 60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む
        ↓
 ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する

(4)
培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL
  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
上澄みをデカンテーションで取り除く
  ↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
  ↓
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
  ↓5min on ice
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
  ↓5min on ice
4℃、15,000rpm、10min遠心
  ↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
  ↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心
70%EtOHを1mL加える(vortex)
  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心
上澄みを捨てる
 ↓30sec 遠心乾燥
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする

(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

・材料
 プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)
1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚
TAE Buffer
Buffer QG
Isopropanol
・実験操作
50V、60minで電気泳動。
          ↓
1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
          ↓ 
EtBrを取り除いた。
          ↓
暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。                    
          ↓
切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g
pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g
          ↓
ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL
pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL
          ↓ 
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)

溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。
          ↓
カラムに移し替え、10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
Buffer PE 0.75mLを加えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
(このエッペンの蓋は切っていない。)
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。

【実験結果】
(1)
コロニー数
pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個     
pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個     →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg
pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個    →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg

平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)

8/19

【時間】 9:00~

【実験担当】岩城、古道、竹内、中村

【実験名】
(1)l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
(3)pSB1C1(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ(18日の続き)
(4)PoxyR、acrABのPCRと電気泳動

【実験目的】
(1)l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る
(3) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
(4)プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
【実験内容】
(1)-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解
          ↓
  DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
          ↓
  on ice 30min
          ↓
  45℃で45sec、ヒートショック
          ↓
  on ice 2min
          ↓
  各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
          ↓
  37℃で1h、振とう培養
          ↓
  培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight

(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした。
       ↓
  37℃でインキュベート 

(3)E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanol 3.5mLを加えた
            ↓
  15,000×g、4℃、30min 遠心
            ↓
  遠心後、上清を捨てた
            ↓
  37℃でインキュベートし、適度に乾燥(乾かしすぎない!)
            ↓
  TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵
            ↓
  これの吸光度を計測した

(4)PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
(組成)
PrimerF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
PrimerR・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
テンプレートDNA(DH5α、JM109)・・・・・・1μL
Buffer for KOD-Plus・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM dNTPs・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM MgSO4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2μL
KOD-Plus(1U/μL)・・・・・・・・・・・・・・・・・・1μL
MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33μL

(設定)
Pre Denature・・・94℃、2min
Denature・・・・・・・94℃、15sec
Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
Extension・・・・・・68℃、20sec
            4℃、∞

PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした

DNA量・・・・・・・・・・・5μL
Loading Buffer・・・・1μL
の割合で、1%アガロースゲルを用いて、100V、15min泳動した

【実験結果】
(3)吸光度の結果
     pSB6    pSB1C3
1回目 1.132    0.155
2回目 0.994    0.138
3回目 0.984    0.126
4回目 0.990    0.122
5回目 0.975    0.125
平均  1.015    0.1332
*DNA1μLに対し、MilliQ99μLを加え。100倍希釈で測定

(4)写真参照

8/18

【時間】 9:00~

【実験担当】岩城、古道、竹内、中村

【実験名】
(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
(2)BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(5)pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(←前日の大量培養がコンタミした為)
(6)pSB1A2の大量培養
(7)pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
【実験目的】
(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のシングルコロニーを得る
(2)BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
(3)作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(5)19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
(6)pSB1A2の大量培養
(7)pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ

【実験内容】
(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)をLBプレート(+amp)にストリーク
              ↓
  37℃でインキュベート(Overnight)


(2)BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート(+amp)にストリーク
              ↓
  37℃でインキュベート(Overnight)

(3)前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
          ↓
  SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養
          ↓
  その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養
          ↓
  吸光度測定した(*実際は牛島さんに測っていただいた)

(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)をDH5αにトランスフォーメーションした
             ↓
  37℃でインキュベート(Overnight)

(5)pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
             ↓
  pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Km)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+クロラムフェニコーム)に大量培養

(7)大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
         ↓
  比重計で、それぞれ等量を量った
         ↓
  各チューブを4℃、4000×gで10min 遠心
         ↓
  この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
         ↓
  遠心後、上清を捨てた
         ↓
  沈殿にR3 4mLを加えて、Vortex
         ↓
  L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置
         ↓
  N3 4mLを加えた
         ↓
  室温、12,000×gで10min遠心
         ↓
  上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
         ↓
  カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
         ↓
  カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
*以降の操作は翌日に繰り越し
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